Antiseptica kunnen door denaturering, precipitatie of oxidatie van proteïnen micro-organismen doden. Ze kunnen ook de enzymatische processen in micro-organismen verstoren of door verandering van de oppervlaktespanning de integriteit van celwand of celmembraan verstoren. Hun werkzaamheid is afhankelijk van de tijdsduur waarin ze in contact zijn geweest met het micro-organisme en van hun concentratie. Ook de temperatuur speelt een belangrijke rol in de werkzaamheid van antiseptica (hoe hoger hoe beter). Aanwezigheid van pus, necrotisch weefsel, bloed, fecesresten en vuil kunnen de werking van antiseptica aanzienlijk verminderen. Voor een zinvolle toepassing van antiseptica is het dan ook noodzakelijk dat het te behandelen oppervlak zoveel mogelijk is gereinigd. De gevoeligheid van de verschillende soorten micro-organismen voor antiseptica is verschillend. Sporevormende bacteriën zijn moeilijk te doden; halogeniden en aldehyden bezitten sporicide eigenschappen. Mycobacteriën zijn veelal resistent tegen antiseptica.
Chloorhexidine is een gesubstitueerde biguanide die de bacteriële membraan beschadigt, met verhoging van de permeabiliteit en lysis van de kiem als gevolg. De werking is bacteriostatisch of bactericide en is vnl. gericht tegen Gram+ en Gram- kiemen, maar ook tegen fungi en bepaalde virussen al werd dit in mindere mate onderzocht. Chloorhexidine wordt niet significant opgenomen door de huid na topicale applicatie. Dit diergeneesmiddel is geïndiceerd voor de pre-operatieve ontsmetting van de huid ter hoogte van het operatieveld.
Jodoforen zijn waterige oplossingen van jodium met surfactantfactoren zoals bijvoorbeeld polyvidone. Ze zijn actief tegen GRAM- en GRAM+, mycobacteriën, bacteriële sporen (hogere dosis en langere contactduur), schimmels en sommige virussen. Ze zijn minder toxisch dan de jodiumtincturen en bezitten een langere werking. Hard water (Ca), vetten en zetmeel (voederresten) hebben een negatief effect op de werking van jodoforen.
