Anthelminticaresistentie en de controle van gastro-intestinale wormen op Vlaamse schapenhouderijen

Anthelmintic resistance and common worm control practices in sheep farms in Flanders, Belgium
Claerebout E., De Wilde N., Van Mael E., Casaert S., Vande Velde F., Roeber F., Vinueza Veloa P., Levecke B., Geldhof P. (2020) Anthelmintic resistance and common worm control practices in sheep farms in Flanders, Belgium Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports 20 (2020) 100393.

Gastro-intestinale nematoden zoals Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta, Nematodirus spp. en Trichostrongylus spp. kunnen bij schapen leiden tot klinische of subklinische gastro-enteritis wat gepaard kan gaan met belangrijke productieverliezen of zelfs sterfte bij lammeren. Door de toenemende resistentie tegen verschillende anthelmintica komt een efficiënte behandeling van deze parasitaire besmettingen bij schapen in gevaar. In een onderzoek van de UGent en Diergezondheid Vlaanderen werd nagegaan in hoeverre anthelminticaresistentie van gastro-intestinale nematoden bij het schaap ook in ons land een probleem vormt en welke factoren op het bedrijf deze resistentie in de hand werken.

Doel van het onderzoek

In het onderzoek uitgevoerd door Claerebout et al. (2020) werd het voorkomen van anthelminticaresistentie in gastro-intestinale nematoden van schapen in Vlaanderen onderzocht en werden de resistente nematoden geïdentificeerd. Daarnaast werden de wormpopulaties die resistent bleken tegen benzimidazoles onderzocht op de aanwezigheid van enkel-nucleotide polymorfie (Eng.: single nucleotide polymorphism of SNP) in het isotype-1 ß-tubulinegen. Bepaalde van deze SNP's worden geassocieerd met benzimidazoleresistentie. Via een enquête uitgevoerd bij Vlaamse schapenhouders werd informatie verzameld over de toegepaste wormcontrolestrategieën en de bedrijfsvoering en over mogelijke risicofactoren die daarbij anthelminticaresistentie in de hand kunnen werken.

Hoe werd het onderzoek uitgevoerd?

Vlaamse schapenhouders werden via Dierengezondheidszorg Vlaanderen (DGZ Vlaanderen) uitgenodigd om aan dit onderzoek deel te nemen. Er werd hen het eerste jaar gevraagd om van een aantal lammeren die niet korter dan 8 weken voordien ontwormd waren, fecesstalen in te zenden. De lammeren werden vervolgens door de schapenhouder ontwormd met een geregistreerd anthelminticum naar keuze. De schapenhouder werd gevraagd om hierbij een aantal van de zwaarste lammeren te wegen en de dosis van het anthelminticum hierop te baseren. Vervolgens moest de schapenhouder na 9-15 dagen bij dezelfde lammeren een tweede fecesstaal nemen en inzenden. Bedrijven waar een verminderde werkzaamheid van het anthelminticum werd vastgesteld, werden het daaropvolgende jaar gecontacteerd om de werkzaamheid opnieuw te beoordelen. Bij deze tweede behandeling werden alle lammeren gewogen om onderdosering uit te sluiten.
Voor elk bedrijf werd de gemiddelde FECR(1) (Faecal Egg Count Reduction) en zijn betrouwbaarheidsinterval berekend. Op basis hiervan werd de wormpopulatie als gevoelig of resistent beoordeeld volgens twee verschillende classificatiecriteria (criteria volgens Coles et al. (1992) en criteria volgens El-Abdellati et al. (2010) (2)). De verschillende nematoden aanwezig in de fecesstalen van voor en na de behandeling werden genetisch geïdentificeerd (multiplexed tandem-PCR). Van de nematoden afkomstig uit stalen van kuddes die met benzimidazoles behandeld werden en waarin een verminderde werkzaamheid van het anthelminticum werd vastgesteld, werd het isotype-1 ß-tubulinegen gekloond. De DNA-sequentie van deze klonen werd bepaald en vergeleken met gepubliceerde sequenties van dit gen om de aanwezigheid van SNP's vast te stellen. 

Onafhankelijk van het voorgaande deel van het onderzoek werden schapenhouders via DGZ Vlaanderen gevraagd om via een online-enquête vragen te beantwoorden over hun kudde, het toegepaste weidemanagement, de aanwezigheid van parasitaire gastro-enteritis in hun kudde, hun kennis over diagnostische testen om infecties met gastro-intestinale nematoden vast te stellen (FEC (1), FAMACHA (3)) en de toegepaste antiparasitaire behandelingen. 

Resultaten voor de werkzaamheid van de gebruikte antiparasitica

In dit onderzoek werden 26 kuddes weerhouden die gemiddeld 10 fecesstalen per kudde ingezonden hebben in 2015. Een aantal van deze bedrijven waar resistentie werd vastgesteld, werd ook in 2016 bemonsterd. Tabel 1 geeft een samenvatting van de gebruikte antiparasitaire groep en zijn werkzaamheid.
Benzimidazoles (BZ) werden in 8 kuddes gebruikt (in 1 van deze kuddes in combinatie met closantel). In nagenoeg al deze kuddes werd er een verminderde werkzaamheid vastgesteld (8 resistente kuddes volgens de criteria van Coles et al. 1992 of 7 resistente en 1 verdachte kudde volgens de criteria van El-Abdellati et al. 2010). Ook in de kudde waar een combinatie van een benzimidazole en closantel werd gebruikt, werd resistentie vastgesteld. Op drie van de bedrijven waar BZ-resistentie werd vastgesteld, werd ook in het daaropvolgende jaar resistentie vastgesteld.
Macrocyclische lactones (ML) werden in 20 kuddes gebruikt. In 3 van deze kuddes gebeurde dit na een falende BZ-behandeling. In een groot deel van de kuddes die met ML behandeld werden, werd een verminderde werkzaamheid vastgesteld (8 resistente kuddes volgens de criteria van Coles et al. 1992 of 3 resistente en 6 verdachte kuddes volgens de criteria van El-Abdellati et al. 2010). Twee bedrijven waar ML-resistentie werd vastgesteld, werden ook het daaropvolgende jaar gecontroleerd. Op 1 van de 2 bedrijven werd opnieuw resistentie vastgesteld, het 2^de bedrijf was verdacht volgens de criteria van El-Abdellati et al. 2010.
Monepantel dat slechts in 1 kudde gebruikt werd, vertoonde een verminderde werkzaamheid.
De auteurs vergelijken hun resultaten met deze die gemeld werden in Nederland waar de resistentie voor BZ in 73% en die voor ML in 47-78% van de kuddes is vastgesteld. Het voorkomen van multipele anthelminticaresistentie die al eerder in 10 Europese landen is gemeld, kon met dit onderzoek niet worden vastgesteld aangezien het aantal schapenhouders dat in deze studie meerdere antiparasitica gebruikte te beperkt was.

H. contortus en/of T. circumcincta waren de meest voorkomende resistente wormsoorten die na de behandeling met BZ of ML werden aangetroffen. Op het bedrijf waar monepantel werd gebruikt, werden vnl. Trichostrongylus spp. en Cooperia curticei als resistente soorten aangetroffen.

Resultaten van het DNA-onderzoek in BZ-resistente nematoden

(zie Bijlage)

Resultaten van de online-enquête

De enquête werd door 113 schapenhouders ingevuld. Deze hadden gemiddeld 14 ooien (gaande van 2 tot 180). Het lammerseizoen liep van de late winter tot het vroege voorjaar. Lammeren stonden meestal 6 à 8 maanden op de weide. Een minderheid van de kuddes (18%) stond het hele jaar door op de weide. Bijna een kwart van de kuddes (24%) graasde samen met andere diersoorten zoals paarden, geiten of koeien. Meestal werden de lammeren één (21%) of meerdere keren (66%) omgeweid. Minder dan de helft van de dieren (41%) werd ontwormd voor ze op een andere weide geplaatst werden. Een minderheid van de schapenhouders (11 %) ontwormden hun schapen nooit. Op de meeste bedrijven was er echter een hoge behandelingsfrequentie (gemiddeld 2,6 x/jaar voor de ooien en 3,2 x/jaar voor de lammeren) en in slechts 4% werden de behandelingen uitgevoerd na het wegen van de dieren. Iets meer dan de helft van de schapenhouders (53%) liet nooit een coprologisch onderzoek uitvoeren. FEC-bepalingen werden meestal gebruikt om bij klinische uitbraken een diagnose te stellen (21%) en slechts op enkele bedrijven (4%) werd er een jaarlijkse FEC uitgevoerd. De auteurs wijzen erop dat frequente behandelingen van de hele kudde en het niet wegen van de dieren belangrijke factoren zijn die de ontwikkeling van anthelminticaresistentie in de hand werken.

Meer dan 4 op 5 schapenhouders in de enquête (84%) beoordeelden de werkzaamheid van de gekozen antiparasitica als heel goed of goed ondanks het feit dat op sommige bedrijven de werkzaamheid van deze middelen lager lag dan 50% en dat 66% van de schapenhouders klinische symptomen meldden die geassocieerd kunnen worden met worminfecties.

Conclusies van de studie

Deze studie toont aan dat anthelminticaresistentie vaak voorkomt op Vlaamse schapenhouderijen. Vooral het feit dat er resistentie wordt opgemerkt in 2 van de belangrijkste pathogene nematoden, H.contortus en T. circumcincta, tegen 2 van de meest gebruikte antiparasitica, benzimidazoles en macrocyclische lactones, is alarmerend. Deze resultaten zijn volgens de auteurs in overeenstemming met deze uit verschillende andere Europese landen waar ook resistentie tegen benzimidazoles, levamisole en macrocyclische lactones gerapporteerd werd in H. contortus, T. circumcincta en Trichostrongylus spp. Ook de resistentie tegen het recentere monepantel die in deze studie werd opgemerkt, werd vastgesteld in andere delen van de wereld en Europa.
Uit de resultaten van de enquête blijkt dat de meeste schapenhouders zich niet bewust zijn van dit probleem en zowel de werking van de gebruikte antiparasitica overschatten, als de impact van aanwezige wormbesmettingen op hun bedrijf onderschatten. Ondermeer de frequente behandelingen van de hele kudde zonder dat de dieren worden gewogen en zonder dat het effect van de behandeling wordt gecontroleerd, zijn niet te rijmen met een duurzaam gebruik van antiparasitica en werken resistentie in de hand. De auteurs pleiten voor de ontwikkeling van efficiënte communicatiestrategieën om de ingesteldheid van de schapenhouder te veranderen en de implementatie van duurzame controlestrategieën te bevorderen.

Waarom is dit onderzoek belangrijk voor de Belgische schapenhouder? - Nawoord van het BCFIvet

Het behoud van de werkzaamheid van antiparasitaire middelen is belangrijk zowel voor het garanderen van het welzijn en de gezondheid van de dieren, als voor het verzekeren van het economisch rendement van het bedrijf.

Ondanks het feit dat de deelnemende bedrijven niet willekeurig en over het ganse land geselecteerd werden, bieden de resultaten van deze studie belangrijke informatie voor de Belgische dierenarts.
Enerzijds bevestigen ze voor het eerst ook voor Vlaanderen de toenemende trend van het voorkomen van anthelminticaresistentie bij de belangrijkste gastro-intestinale nematoden van het schaap zoals die in Europa en in andere delen van de wereld wordt vastgesteld. Hierbij valt op te merken dat deze resistentie zich niet beperkt tot benzimidazoles of levamisol, zoals nog vaak wordt aangenomen, maar dat ook resistentie tegen macrocyclische lactones en monepantel aanwezig kan zijn. Anderzijds legt het onderzoek ook indirect de noodzaak bloot voor een intensieve(re) diergeneeskundige bedrijfsbegeleiding van schapenhouderijen, inclusief hobbykwekers, inzake het gebruik van anthelmintica en de implementatie van een duurzame wormcontrole, die een bedrijfsspecifieke aanpak vereist en gebaseerd moet zijn op actuele, wetenschappelijke bewijzen.

Meer lezen?

De belangrijkste principes van een duurzaam gebruik van anthelmintica werden reeds eerder besproken in de Folia Veterinaria.

Meer informatie over anthelminticaresistentie in Europa:

• Rose et al., - 2015 - Widespread anthelmintic resistance in European farmed ruminants: a systematic review Veterinary Record 176(21):546. doi: 10.1136/vr.102982

Meer informatie over risicofactoren voor anthelminticaresistantie bij schapen:

• Falzon et al. – 2014 - A systematic review and meta-analysis of factors associated with anthelmintic resistance in sheep. Preventive Veterinary Medicine Vol. 117,iss. 2 pp. 388-402. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2014.07.003
• Best-practice framework on the use of anthelmintics in food-producing animals - European Platform for the Responsible Use of Medicines in Animals (Epruma).
• Sustainable Control of Parasites

Bijlage

Resultaten van het DNA-onderzoek in BZ-resistente nematoden

BZ-resistentie in gastro-intestinale nematoden wordt geassocieerd met wijzigingen van het 1 β-tubuline-eiwit die veroorzaakt worden door SNP's in het isotype 1 β-tubulinegen. Met name aminozuursubstituties op posities 200, 167 en 198 van het 1 β-tubuline die hiervan een gevolg zijn, worden in verband gebracht met BZ-resistentie in verschillende nematodenspecies.
Vooral de substitutie van fenylalanine door tyrosine op positie 200 (F200Y) is een belangrijke merker voor BZ-resistentie. Voor het merendeel (26 van de 34) van de onderzochte H. contortus klonen kwam de DNA-sequentie van het isotype 1 β-tubulinegen  overeen met die van H. contortus. In 92% van deze klonen deed er zich een substitutie voor op positie 200 (F200Y), in 8% op positie 167 (F167Y). Polymorfisme op positie 198 werd niet vastgesteld.
Verrassend genoeg bleek in de overige 8 H. contortus klonen het isotype 1 β-tubulinegen de meeste overeenkomst te vertonen met de DNA-sequentie van T. colubriformis isotype 1 β-tubulinegen. In al deze klonen was er een wijziging in positie 200 (F200Y). Polymorfisme op andere plaatsen werd niet vastgesteld.
In T. circumcincta werd slechts in 43% van de klonen een F200Y-substitutie vastgesteld, in 10% een E198A (substitutie van glutaminezuur door alanine op het β-tubuline-eiwit) en in 47% een E198L substitutie (substitutie van glutaminezuur door leucine). E198L-substitutie werd eerder al vastgesteld bij BZ-resistentie in T. circumcincta in het Verenigd Koninkrijk en Ierland. De betekenis hiervan voor BZ-resistentie is nog niet gekend.

1. FECR: is gebaseerd op de bepaling van de FEC (Faecal Egg Count) die voor en na de behandeling worden bepaald. De FEC’s, uitgedrukt in aantal eieren per gram mest (EPG), werden in deze studie bepaald met de Mini-FLOTAC-techniek (detectielimiet 5 EPG)

2. De huidige definitie van een resistente strongylidenpopulatie is gebaseerd op de criteria die geformuleerd zijn door Coles et al., 1992. Hierbij is de populatie ‘resistent’ wanneer FECR<95% en de lagere grens van het 95% betrouwbaarheidsinterval (LL)<90% en als ‘gevoelig’ wanneer FECR ≥95% en LL ≥90%. In alle andere gevallen wordt de populatie als ‘verdacht’ beschouwd. Volgens de criteria van El-Abdellati et al., (2010) is de populatie ‘resistent’ wanneer de bovenste grens van het 95% betrouwbaarheidsinterval (UL) < 95% en ‘gevoelig’ wanneer LL ³ 95%. In alle andere gevallen wordt de populatie als ‘verdacht’ beschouwd.

3. FAMACHA (Faffa MAlan CHArt): de beoordeling van de graad van anemie wordt gekoppeld aan de noodzaak om een dier al of niet te behandelen. Het gebruik van FAMACHA maakt een selectieve behandeling van een deel van de kudde mogelijk terwijl het overige deel niet wordt behandeld. De druk op de selectie van resistente wormen wordt op die manier verminderd.